پروتئین های فلورسنت

مهندسی پروتئین فلورسنت

تک ذره و پروتئین های فلورسنت

این ماژول از سه بخش تشکیل خواهد شد. بخش اول تئوری و کاربردهای منتخب میکروسکوپ بازتاب داخلی کل (TIRF) با نسبت سیگنال به نویز بالا و وضوح فضایی در مطالعات فلورسانس تک مولکولی و FRET را شرح می‌دهد.

بخش بعدی بر نحوه مطالعه قاچاق گیرنده با استفاده از فناوری های تصویربرداری متمرکز خواهد بود. ما روش‌هایی را برای دنبال کردن گیرنده‌های اندوسیتی از سطح و از طریق سیستم اندوسومی دنبال می‌کنیم و نشان می‌دهیم که چگونه گیرنده‌ها در سلول‌های اندوتلیال و اپیتلیال پلاریزه شده ترانس سیتوز شوند.

بخش آخر بر چگونگی استفاده از پروتئین های فلورسنت و روش های تصویربرداری زیستی برای مطالعه اثرات کانال های آب آکواپورین بر مهاجرت سلولی و چسبندگی سلولی متمرکز خواهد بود.

علاوه بر سخنرانی‌ها، این ماژول شامل یک تمرین ImageJ در ردیابی سلول‌های زنده و مهاجر و همچنین یک تور تسهیلات خواهد بود.

لیزر برای میکروسکوپ کانفوکال

لیزرها زمانی "راه حلی برای جستجوی مشکل" نامیده می شدند. این کلمه-که مخفف عبارت Light Amplification by Stimulated Emission of تابش است-برای به تصویر کشیدن تصاویر سلاح های مرگبار از فیلم ها و سریال های علمی تخیلی استفاده می شود. با این حال ، استفاده روزافزون آنها در زندگی روزمره ، ابتدا در دستگاه های پخش سی دی و سپس در اسکنرها و نشانگرهای بارکد ، باعث شده است که آنها به نظر برسند.

آنها همچنین برای میکروسکوپ کانفوکال مناسب هستند.

منبع نوری مناسب برای میکروسکوپ کانفوکال

اولین انتشار لیزر توسط تئودور میمن در 16 مه 1960 ایجاد شد و کار در Nature منتشر شد - پس از رد شدن توسط Physical Review Letters.

اما چه چیزی لیزرها را بسیار خاص می کند؟ پاسخ آسان است: توانایی آنها در ایجاد یک پرتو شدید و بسیار باریک از نور به طول یک موج. این پرتو در فواصل بسیار طولانی باریک می ماند ، که این امر را برای کاربردهای طولانی مدت بسیار مفید می کند ، مانند پرتاب آن از یک بازتابنده کوچک در سطح ماه. قطر کوچک پرتو لیزر آنها را به ویژه به عنوان منابع نوری برای میکروسکوپ اسکن کانفوکال مناسب می کند.

منبع نوری مناسب برای روشنایی کانونی باید روشن ، پایدار ، به راحتی متمرکز و البته در طول موج مناسب باشد. سایر ملاحظات عبارتند از میزان تولید گرما و سر و صدا و بدیهی است که هزینه خرید و اجرای آن شامل مصرف انرژی است.

روشنایی

قدرت در واحد سطح یا روشنایی مشخصه لیزرها است. از آنجا که قطر پرتو لیزر معمولاً در محدوده کمتر از یک میلی متر است ، حتی یک لیزر چند مگاواتی نقطه ای از نور بسیار روشن را تولید می کند ، دقیقاً به این دلیل که تمام انرژی آن بر آن نقطه متمرکز است. به هر حال ، این چیزی است که لیزر را برای چشم خطرناک می کند.

یکنواختی و ثبات روشنایی

شدت ، مشخصات پرتو و جهت ، همه عوامل مهمی در حین تهیه تصویر هستند که روشنایی یکنواخت را تضمین می کنند. روشنایی باید نه تنها در حین کسب بلکه در روز به روز پایدار باشد تا مقایسه اندازه گیری های انجام شده در روزهای مختلف امکان پذیر باشد.

تمرکز

توانایی تمرکز نور بر روی نقطه محدود با پراش از اهمیت بالایی در میکروسکوپ کانونی برخوردار است. تمرکز لیزری که با پرتو غیر واگرا ساطع می کند بسیار آسان است.

طول موج

طول موج ، که به نوع لیزر متصل است ، بیشترین بحث را دارد. در حقیقت ، نوع لیزر دارای بخش مخصوص به خود است و انتخاب نوع لیزر را می توان یکی از مهمترین تصمیمات دانست.

انواع لیزر

3 نوع اصلی لیزر در میکروسکوپ کانفوکال استفاده می شود:

گاز: لوله های شیشه ای یا کوارتز پر از گاز که توسط تخلیه های الکتریکی ولتاژ بالا پمپ می شوند

نیمه هادی: دیودهایی که با اعمال جریان در محل اتصال لایه های نیمه هادی پمپ می شوند

کریستال (حالت جامد): میله های بلور فلورسنت که توسط نور در طول موج مناسب پمپ می شوند

البته هر دو دستگاه دیود و کریستال حالت جامد دارند ، اما نحوه عملکرد آنها متفاوت است. بنابراین ، آنها به طور جداگانه طبقه بندی می شوند - معمولاً "حالت جامد" به لیزرهای کریستالی اشاره دارد. این امر برای ما که به hi-fi علاقه داریم ، گیج کننده است ، جایی که "حالت جامد" همیشه به تجهیزات دیود (ترانزیستور) اشاره می کند ، در مقایسه با دستگاه های خلاء لوله!

گاز

هنگامی که میکروسکوپ کانفوکال به صورت تجاری در دسترس قرار گرفت ، از گاز ، هلیوم نئون (HeNe) ، لیزرها به عنوان منابع نوری استفاده شد. این لیزرها نسبتاً ضعیف ، در حدود 0.5 میلی وات ، با خطوط در 633 نانومتر و 543 نانومتر بودند ، دومی برای فلوروکروم های محدودی که در آن زمان در دسترس بود مفیدتر بود. لیزر گازی دیگر ، لیزر Argon (Ar) با دو انتشار برجسته در 488 نانومتر و 514 نانومتر بهتر بود ، به ویژه اینکه خط 488 نانومتر آن FITC کامل و مشتقات آن و همچنین GFP است. لیزرهای Ar هنوز هم امروزه مورد استفاده قرار می گیرند و پنج خط تحریک مختلف در محدوده آبی/سبز-سبز ارائه می دهند.

کریستال و دیود

اگرچه لیزرهای گازی هنوز در حال استفاده هستند ، اما واحدهای کریستالی و دیودی در حال تسخیر هستند. آنها پایدارتر هستند و گرمای کمتری تولید می کنند. بنابراین ، لیزرهای کریستالی و دیودی نیازی به خنک کننده فن فعال ندارند. اگر ساعات طولانی را از کانفوک استفاده می کنید ، برای گوش شما بسیار مفید است. آنها همچنین طیف وسیعی از طول موجها را منتشر می کنند. اکثر آنها لیزرهای پالسی هستند ، که آنها را برای تصویربرداری طول عمر فلورسانس (FLIM) نیز مناسب می کند. آنها فقط می توانند در یک طول موج ساطع کنند ، بنابراین تعدادی منبع لیزر برای طول موج های متعدد مورد نیاز است ، با پنج خط مختلف که معمولاً برای طیف وسیعی از رنگها در محدوده قابل مشاهده برانگیخته می شوند.

امروزه از لیزرهای دیود 405 نانومتری برای UV استفاده می شود ، زیرا می توانند DAPI را به شدت تحریک کنند (البته در لبه منحنی تحریک آن) که طول موجهای کوتاهتری لازم نیست. این لیزرها همچنین می توانند برای پروتئین های فلورسنت تحریک شده با رنگ آبی عمیق استفاده شوند.

لیزرها می توانند در میکروسکوپ کانفوکال به روشهای پیشرفته تر و همه کاره تر از فلوروفورهای هیجان انگیز با استفاده از تعداد معینی و طول موج استفاده شوند. این نتیجه توسعه کلاسهای جدید لیزر است که در مقاله دیگری به آن خواهیم پرداخت.

میکروسکوپ

انواع مختلف لیزر با مشخصات قابل استفاده در انواع مختلف میکروسکوپ از جمله تصویربرداری از میدان دور فلورسانس ، تصویربرداری از میدان گسترده ، میکروسکوپ اسکن کانفوکال و میکروسکوپ mutiphoton. این لیزرها شامل لیزرهای قطبی شده فیبر CW ، لیزرهای نزدیک به IR و قابل مشاهده Raman و لیزرهای ترکیبی فوق سریع Mid-IR هستند. سیستم های منحصر به فرد ما نور شدید را در نزدیکی IR ، Mid-IR و طول موج های قابل مشاهده مورد نیاز برای نشانگرهای مهیج فلورسنت ، به ویژه پروتئین های فلورسنت اسب کار فراهم می کنند.

 

مبانی تصویربرداری فلورسانس

تصویربرداری فلورسانس ، در مقیاس های کلان ، خرد و زیر میکرو ، در 30 سال گذشته انقلابی در علوم زیستی ایجاد کرده است. ایمونولابلینگ هدف گذاری دقیق مولکول ها در بافت ثابت را فراهم کرده است ، در حالی که پروتئین های فلورسنت محلی سازی در بافت های زنده را امکان پذیر کرده است. شاخص های فلورسنت تصویربرداری از تغییرات پویا در متابولیسم سلول را امکان پذیر می کند.

میکروسکوپ چند فوتون

تکامل بعدی در میکروسکوپ multiphoton ، توانایی مشاهده فرآیندهای بیولوژیکی پیچیده و پویا را از عمق بیشتری در بافت زنده با حداقل تهاجم و عکسبرداری بیشتر خواهد کرد.

مقدمه

میکروسکوپ Multiphoton (MPM) به عنوان روش انتخاب برای تصویربرداری از بافتهای بیولوژیکی زنده و دست نخورده در مقیاس های طول از سطح مولکولی از طریق کل ارگانیسم در نظر گرفته شده است. 

میکروسکوپ فلورسانس

میکروسکوپ فلورسانس یک میکروسکوپ نوری است که از فلورسانس به جای پراکندگی ، بازتاب و ضعف یا جذب استفاده می کند تا خواص مواد آلی یا معدنی را مورد مطالعه قرار دهد. "میکروسکوپ فلورسانس" به هر میکروسکوپی که از فلورسانس برای تولید یک تصویر استفاده می شود ، اطلاق می شود ، خواه مجموعه ای ساده تر مانند میکروسکوپ اپی فلوئورسانس باشد یا طرحی پیچیده تر مانند میکروسکوپ کانفوکال ، که از برش نوری استفاده می کند تا وضوح بهتری از فلورسانس بدست آورد تصویر

توموگرافی پیش بینی نوری

توموگرافی پیش بینی نوری نوعی توموگرافی است که شامل میکروسکوپ نوری است. [1] تکنیک OPT گاهی اوقات به عنوان توموگرافی کامپیوتری نوری (نوری-CT) و توموگرافی کامپیوتری انتشار نوری (نوری-ECT) در ادبیات گفته می شود تا این واقعیت را که این تکنیک شباهتی با توموگرافی کامپیوتری اشعه ایکس (CT) و مجرد دارد ، بیان کند. توموگرافی کامپیوتری انتشار فلفون (SPECT). [2]

پروب های نوری در زیست شناسی