تصویربرداری عمیق ساختاری و عملکردی از مغز با استفاده از میکروسکوپ سه فوتونی اپتیک تطبیقی

خلاصه

میکروسکوپ چند عکاسی به ابزاری قدرتمند تبدیل شده است که با آن می توان مورفولوژی و عملکرد سلول ها و مدارهای عصبی در مغز پستانداران سالم را تجسم کرد. با این حال ، پراکندگی بافت ، انحرافات نوری و مصنوعات حرکتی عملکرد تصویربرداری را در عمق تنزل می دهند. در اینجا ما یک روش تصویربرداری داخل تهاجمی با حداقل تهاجم را بر اساس تحریک سه فوتونی ، اپتیک تطبیقی ​​غیرمستقیم (AO) و نوار الکتروکاردیوگرام فعال برای پیشبرد تصویربرداری از بافت عمیق توصیف می کنیم. رویکرد AO بدون سنسور مبتنی بر روش ما نسبت به سیگنال به نویز کم قوی است که معمولاً در بافتهای پراکنده عمیق مانند مغز موش مشاهده می شود و تصحیح AO را در زمینه های دید محوری بزرگ مجاز می کند. ما تصویربرداری تقریباً پراش محدودی از خارهای عمقی قشر و دندریت های (زیر) قشری تا عمق 1.4 میلی متر (لبه هیپوکامپ CA1 موش) را نشان می دهیم. علاوه بر این ، ما برنامه های کاربردی برای تصویربرداری کلسیم لایه نازک از آستروسیت ها ، از جمله آستروسیت های فیبری را که در بدن پراکنده بسیار قرار دارند نشان می دهیم.

اصلی

در بافتهای پراکنده مانند مغز پستانداران ، میکروسکوپ تحریک دو فوتونی (2 PM) استاندارد طلایی برای ثبت ساختار و عملکرد سلولی در شرایط غیرتهاجمی و فیزیولوژیکی مرتبط در داخل بدن 1،2 است. با این حال ، حداکثر عمق نفوذ میکروسکوپ های دو فوتونی اساساً با شروع فلورسانس خارج از کانون در نزدیکی سطح با افزایش قدرت تحریک محدود می شود ، که برای مغز پستانداران از تصویربرداری بیش از 1 میلی متر جلوگیری می کند (مرجع 3). رویکردهای تصویربرداری بر اساس میکروسکوپ تحریک سه فوتونی (3 PM) با توجه به افزایش قابل توجه نسبت سیگنال به پس زمینه (SBR) در عمق و طول موج طولانی تر ، امکان تصویربرداری عمیق فراتر از 1 میلی متر با وضوح سلولی را نشان داده است. 7

با این حال ، مانند ساعت 2 بعدازظهر ، با افزایش عمق تصویربرداری ، انحرافات نوری به دلیل ناهمگونی بافت ها و عدم تطابق ضریب شکست و مصنوعات حرکتی ظریف به دلیل ضربان قلب حیوان ، کاهش وضوح تصویر و عملکرد کلی ، و منجر به از دست دادن جزئیات زیر سلولی می شود. این امر تا کنون حل فرایندهای عصبی خوب ، سیناپس ها و گذرگاههای زیر سلولی+ Ca2 در نواحی عمیق قشری و زیر قشری مغز موش را در شرایط in vivo بدون استفاده از روشهای بسیار تهاجمی مانند کاشت لنز شاخص گرادیان 8 یا آسپیراسیون قشری 9 ممنوع کرده است. در حالی که انحرافات نوری را می توان با استفاده از روش های اپتیک تطبیقی ​​(AO) اندازه گیری و جبران کرد 10،11 ، پیاده سازی های قبلی عمدتا بر اساس ساعت 2 بعد از ظهر انجام شد و بنابراین عمق تصویربرداری موثر آنها حداکثر تا 800 میکرومتر در مغز موش محدود شد 12 ، 13 ، 14 ، 15 به رویکردهای جایگزین مبتنی بر شکل دهی به موج می تواند حتی در رسانه های بسیار پراکنده تصویر کند ، اما محدوده دید محدود (FOV) تنها ده ها میکرومتر و/یا زمانهای همبستگی سریع ، کاربرد مفید آنها را در شرایط درون بینی واقعی ممنوع کرده است 16،17،18 به

یک چالش دیگر در تصویربرداری عمیق از مغز این است که در اعماق بافت بزرگ ، ضربان قلب منجر به مصنوعات حرکتی درون چارچوبی می شود که از افزایش میانگین فریم برای افزایش نسبت سیگنال به نویز (SNR) جلوگیری می کند ، یک تکنیک استاندارد که برای حل قابل اعتماد کوچک ضروری است. ساختارهایی مانند دندریت ها و ستون فقرات فردی.

برای رفع نواقص فوق ، ما یک روش تصویربرداری داخل تهاجمی با حداقل تهاجم بر اساس 3 بعد از ظهر ، تصحیح AO غیرمستقیم و نوار الکتروکاردیوگرام فعال (ECG) برای دستیابی به تصحیح انحراف و وضوح محدود پراش تا عمق بیش از 1.4 میلی متر در ماوس ایجاد کردیم. مغز این ما را قادر می سازد تا سیناپس های فردی را تا حدود 900 میکرومتر در قشر و فرایندهای دندریتیک خوب را در هیپوکامپ در عمق بیش از 1.4 میلی متر حل کنیم. علاوه بر این ، رویکرد غیر تهاجمی ما در ویژگی های عملکردی آستروسیت های فیبری در ماده سفید به دست آورد و گذرهای Ca2+ را در ریز دامنه های فردی حل کرد.