تصویربرداری عمیق ساختاری و عملکردی از مغز با استفاده از میکروسکوپ سه فوتونی اپتیک تطبیقی

خلاصه

میکروسکوپ چند عکاسی به ابزاری قدرتمند تبدیل شده است که با آن می توان مورفولوژی و عملکرد سلول ها و مدارهای عصبی در مغز پستانداران سالم را تجسم کرد. با این حال ، پراکندگی بافت ، انحرافات نوری و مصنوعات حرکتی عملکرد تصویربرداری را در عمق تنزل می دهند. در اینجا ما یک روش تصویربرداری داخل تهاجمی با حداقل تهاجم را بر اساس تحریک سه فوتونی ، اپتیک تطبیقی ​​غیرمستقیم (AO) و نوار الکتروکاردیوگرام فعال برای پیشبرد تصویربرداری از بافت عمیق توصیف می کنیم. رویکرد AO بدون سنسور مبتنی بر روش ما نسبت به سیگنال به نویز کم قوی است که معمولاً در بافتهای پراکنده عمیق مانند مغز موش مشاهده می شود و تصحیح AO را در زمینه های دید محوری بزرگ مجاز می کند. ما تصویربرداری تقریباً پراش محدودی از خارهای عمقی قشر و دندریت های (زیر) قشری تا عمق 1.4 میلی متر (لبه هیپوکامپ CA1 موش) را نشان می دهیم. علاوه بر این ، ما برنامه های کاربردی برای تصویربرداری کلسیم لایه نازک از آستروسیت ها ، از جمله آستروسیت های فیبری را که در بدن پراکنده بسیار قرار دارند نشان می دهیم.

اصلی

در بافتهای پراکنده مانند مغز پستانداران ، میکروسکوپ تحریک دو فوتونی (2 PM) استاندارد طلایی برای ثبت ساختار و عملکرد سلولی در شرایط غیرتهاجمی و فیزیولوژیکی مرتبط در داخل بدن 1،2 است. با این حال ، حداکثر عمق نفوذ میکروسکوپ های دو فوتونی اساساً با شروع فلورسانس خارج از کانون در نزدیکی سطح با افزایش قدرت تحریک محدود می شود ، که برای مغز پستانداران از تصویربرداری بیش از 1 میلی متر جلوگیری می کند (مرجع 3). رویکردهای تصویربرداری بر اساس میکروسکوپ تحریک سه فوتونی (3 PM) با توجه به افزایش قابل توجه نسبت سیگنال به پس زمینه (SBR) در عمق و طول موج طولانی تر ، امکان تصویربرداری عمیق فراتر از 1 میلی متر با وضوح سلولی را نشان داده است. 7

با این حال ، مانند ساعت 2 بعدازظهر ، با افزایش عمق تصویربرداری ، انحرافات نوری به دلیل ناهمگونی بافت ها و عدم تطابق ضریب شکست و مصنوعات حرکتی ظریف به دلیل ضربان قلب حیوان ، کاهش وضوح تصویر و عملکرد کلی ، و منجر به از دست دادن جزئیات زیر سلولی می شود. این امر تا کنون حل فرایندهای عصبی خوب ، سیناپس ها و گذرگاههای زیر سلولی+ Ca2 در نواحی عمیق قشری و زیر قشری مغز موش را در شرایط in vivo بدون استفاده از روشهای بسیار تهاجمی مانند کاشت لنز شاخص گرادیان 8 یا آسپیراسیون قشری 9 ممنوع کرده است. در حالی که انحرافات نوری را می توان با استفاده از روش های اپتیک تطبیقی ​​(AO) اندازه گیری و جبران کرد 10،11 ، پیاده سازی های قبلی عمدتا بر اساس ساعت 2 بعد از ظهر انجام شد و بنابراین عمق تصویربرداری موثر آنها حداکثر تا 800 میکرومتر در مغز موش محدود شد 12 ، 13 ، 14 ، 15 به رویکردهای جایگزین مبتنی بر شکل دهی به موج می تواند حتی در رسانه های بسیار پراکنده تصویر کند ، اما محدوده دید محدود (FOV) تنها ده ها میکرومتر و/یا زمانهای همبستگی سریع ، کاربرد مفید آنها را در شرایط درون بینی واقعی ممنوع کرده است 16،17،18 به

یک چالش دیگر در تصویربرداری عمیق از مغز این است که در اعماق بافت بزرگ ، ضربان قلب منجر به مصنوعات حرکتی درون چارچوبی می شود که از افزایش میانگین فریم برای افزایش نسبت سیگنال به نویز (SNR) جلوگیری می کند ، یک تکنیک استاندارد که برای حل قابل اعتماد کوچک ضروری است. ساختارهایی مانند دندریت ها و ستون فقرات فردی.

برای رفع نواقص فوق ، ما یک روش تصویربرداری داخل تهاجمی با حداقل تهاجم بر اساس 3 بعد از ظهر ، تصحیح AO غیرمستقیم و نوار الکتروکاردیوگرام فعال (ECG) برای دستیابی به تصحیح انحراف و وضوح محدود پراش تا عمق بیش از 1.4 میلی متر در ماوس ایجاد کردیم. مغز این ما را قادر می سازد تا سیناپس های فردی را تا حدود 900 میکرومتر در قشر و فرایندهای دندریتیک خوب را در هیپوکامپ در عمق بیش از 1.4 میلی متر حل کنیم. علاوه بر این ، رویکرد غیر تهاجمی ما در ویژگی های عملکردی آستروسیت های فیبری در ماده سفید به دست آورد و گذرهای Ca2+ را در ریز دامنه های فردی حل کرد.

روش میکروسکوپی تصویربرداری عمیق از داخل مغز را قادر می سازد

هایدلبرگ ، آلمان ، اکتبر 4 ، 2021 - روشی که توسط گروه Prevedel در آزمایشگاه زیست شناسی مولکولی اروپا (EMBL) توسعه یافته است به دانشمندان عصبی اجازه می دهد تا نورونهای زنده را در اعماق مغز - یا هر سلول دیگری که در بافت مات مخفی شده است ، مشاهده کنند. این روش بر اساس میکروسکوپ سه فوتونی و اپتیک تطبیقی ​​است.

این روش توانایی دانشمندان برای مشاهده آستروسیت های تولید کننده کلسیم در لایه های عمیق قشر را افزایش می دهد و سایر سلول های عصبی را در هیپوکامپ ، ناحیه ای از مغز که مسئول حافظه و ناوبری فضایی است ، تجسم می کند. این پدیده به طور منظم در مغز همه پستانداران زنده اتفاق می افتد. لینا استرایچ از گروه Prevedel و همکارانش توانستند از این تکنیک برای ثبت جزئیات خوب این سلول های همه کاره با وضوح بالای بی سابقه استفاده کنند.

یک آینه تغییر شکل پذیر که در میکروسکوپ برای تمرکز نور در بافتهای زنده استفاده می شود. یک تیم EMBL نوری تطبیقی ​​و میکروسکوپی سه فوتونی را برای پشتیبانی از توانایی پرسنل پزشکی در تصویربرداری در اعماق هیپوکامپ ترکیب کرد. با احترام از ایزابل رومرو کالوو ، EMBL.

در علوم اعصاب ، بافتهای مغز معمولاً در موجودات مدل کوچک یا نمونه های in vivo مشاهده می شوند که برای مشاهده نیاز به برش دارند - که هر دو نشان دهنده شرایط غیر فیزیولوژیکی هستند. فعالیت طبیعی سلولهای مغزی فقط در حیوانات زنده صورت می گیرد. به گفته روبرت پرودل ، مغز موش یک بافت بسیار پراکنده است. وی گفت: "در این مغزها ، نور نمی تواند به راحتی متمرکز شود ، زیرا با اجزای سلولی در تعامل است." "این امر می تواند تا چه اندازه عمیق باشد که می توانید یک تصویر واضح ایجاد کنید ، و تمرکز بر ساختارهای کوچک در اعماق مغز با تکنیک های سنتی را بسیار دشوار می کند.

"با تکنیک های میکروسکوپ مغزی فلورسانس سنتی ، هر بار دو فوتون توسط مولکول فلورسانس جذب می شود و می توانید مطمئن شوید که هیجان ناشی از تابش محدود به حجم کمی است. اما هرچه فوتون ها بیشتر حرکت کنند ، احتمال از بین رفتن آنها بر اثر پراکندگی بیشتر است. "

یکی از راه های غلبه بر این ، افزایش طول موج فوتون های هیجان انگیز به سمت مادون قرمز است که انرژی تابشی کافی را برای جذب توسط فلوروفور تضمین می کند. علاوه بر این ، استفاده از سه فوتون به جای دو باعث می شود تصاویر واضح تری در اعماق مغز به دست آید. با این حال ، چالش دیگری باقی ماند: اطمینان از فوکوس فوتون ها ، به طوری که کل تصویر تار نشود.

استرایچ و تیمش از اپتیک تطبیقی ​​استفاده کردند که اغلب در نجوم استفاده می شود. اخترفیزیکدانها از آینه های تغییر شکل پذیر و با کنترل رایانه برای تصحیح اعوجاج در امواج نور ناشی از تلاطم جوی در زمان واقعی استفاده می کنند. در آزمایشگاه Prevedel ، اعوجاج ناشی از پراکندگی بافت ناهمگن است ، اگرچه اصل و فناوری بسیار مشابه هستند.

پروددل می گوید: "ما همچنین از یک آینه تغییر شکل پذیر کنترل می کنیم که قادر است جبهه های موج را بهینه کرده و اجازه دهد نور حتی در اعماق مغز متمرکز و متمرکز شود." "ما یک رویکرد سفارشی برای استفاده سریع از سلولهای زنده در مغز ایجاد کردیم."

برای کاهش تهاجم این تکنیک ، تیم همچنین تعداد اندازه گیری های مورد نیاز برای به دست آوردن تصاویر با کیفیت بالا را به حداقل رساند.

استرایچ گفت: "این اولین بار است که این تکنیک ها با هم ترکیب شده اند و به لطف آنها ، ما توانستیم عمیق ترین تصاویر زنده از نورونهای زنده را با وضوح بالا نشان دهیم."

دانشمندان که با همکاری همکاران EMBL رم و دانشگاه هایدلبرگ کار کردند ، حتی دندریت ها و آکسون هایی را که نورون های هیپوکامپ را به هم متصل می کنند ، تجسم کردند ، در حالی که مغز را کاملاً دست نخورده رها کردند.

استرایچ گفت: "این یک جهش به سوی توسعه تکنیک های پیشرفته تر غیرتهاجمی برای مطالعه بافت های زنده است."

به گفته محققان ، اگرچه این تکنیک برای استفاده روی مغز موش توسعه یافته است ، اما به راحتی برای هر بافت مات قابل استفاده است.

"علاوه بر مزیت آشکار امکان مطالعه بافت های بیولوژیکی بدون نیاز به قربانی کردن حیوانات یا برداشتن بافت پوشیده شده ، این تکنیک جدید راه را برای مطالعه طولی حیوانات ، یعنی از شروع بیماری تا انتها باز می کند." "استرایچ گفت. "این به دانشمندان ابزاری قدرتمند برای درک بهتر چگونگی توسعه بیماری ها در بافت ها و اندام ها می دهد."